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    明膠酶譜分析試劑盒

    明膠酶譜分析試劑盒

    簡(jiǎn)要描述:明膠酶譜分析試劑盒(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱(chēng)膠原酶。通過(guò)影響細胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。明膠酶譜法試劑盒!所有產(chǎn)品僅供科研使用,不得用于食用,醫療等其它用途。

    產(chǎn)品型號:

    所屬分類(lèi):明膠酶譜法試劑盒

    更新時(shí)間:2022-08-30

    廠(chǎng)商性質(zhì):其他

    詳情介紹

    明膠酶譜分析試劑盒

    MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

     

    1. 簡(jiǎn)介:

    基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱(chēng)膠原酶。通過(guò)影響細胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

     

    2. 檢測原理:

    本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達1 nM,高于ELISA方法,其基本原理1和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳,電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區域,從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標準小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15個(gè),則總計可檢測500~750個(gè)樣品。

     

    3. 檢測目的:

    本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM)。

     

    4.  試劑盒組成與儲存:

    A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC;

    B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC;

    C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?/span>

    D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?/span>

    E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液, 4 oC。

     

    5.檢測步驟

    5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 oC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。

    5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^(guò)預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker 即可。

    陽(yáng)性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。

    注:因為全血成分復雜,MMP活性較低,的方法是將全血中白細胞進(jìn)行分離做陽(yáng)性對照

    5.3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時(shí)結束電泳。

    5.4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

    5.5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37oC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低,應延長(cháng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

    5.6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說(shuō)明書(shū))。凝膠的大部分區域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。

    透明區域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。

    5.7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。

    明膠酶譜法試劑盒

    6.說(shuō)明

    1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。

    2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。

    明膠酶譜分析試劑盒

    7.參考文獻:

    1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

    2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

    gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102,196–202

     

    SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說(shuō)明書(shū)

    常規考馬斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高,但所需試劑復雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。

     

    染色步驟:

    1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝

    膠,并緩慢搖動(dòng)2h;

    2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;

    3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng)2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景(通常此過(guò)程需要24h,也可脫色過(guò)夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景);

    4. 對凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對

    凝膠進(jìn)行處理后保存。

    安全性:含有甲醇,無(wú)特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規程處理。

    說(shuō)明:

    1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用

    Whatman 1 號濾紙過(guò)濾,于室溫可無(wú)限期保存;

    2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88V:V:V);

    3. 保存液:7%冰醋酸;

    4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內,室溫或4 oC 保存,可反復使用2-4 次。

    所有產(chǎn)品僅供科研使用,不得用于食用,醫療等其它用途。

     



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